皮肤衰老的指标有哪些

皮肤衰老的特征标志物：细胞形态变大，扁平，细胞核体积增大；衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）酶活性增强；p53、p21和p16表达上调；Lamin B1下调；ATM表达下调；稳定的DNA损伤反应（DDR）；HMGB1核移位至细胞质和细胞外液；衰老相关分泌表型（SASP）的分泌，包括基质金属蛋白酶（MMPs）和炎症因子（IL-1, IL-6, IL-8等）；以及脂褐质和ROS的大量积累等……

衰老相关分泌表型（SASP）是衰老细胞分泌的一种促炎症表型。SASP包括一系列细胞因子和生长因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TGF-β、趋化因子、基质金属蛋白酶等。这些因子通过与免疫系统协作，改善细胞微环境的同时，影响邻近细胞的增殖与分化。多种转录因子和信号通路参与SASP的调控。例如，NF-κB、p53、p21、p16和Rb等单独或协同激活SASP；ATM、CHK2、ATR、GATA4和聚合酶1（PARP1）等DNA损伤反应（DDR）蛋白也参与SASP的调节网络。

图1 皮肤衰老相关影响因素及作用机制^[1,2]

图2 皮肤衰老相关生物指标^[3]

1.基于人皮肤角质形成细胞的抗衰功效测定

角质形成细胞数量占表皮细胞的80%以上，是表皮的主要构成细胞。在向角质细胞转化的过程中，角质形成细胞可分为四个层次，分别是基底层、棘层、颗粒层和角质层。表皮中紫外线敏感的靶细胞主要是角质形成细胞。近年来，众多研究表明，人角质形成细胞在光老化的起始与演进过程中扮演着举足轻重的角色，并且在加剧炎症反应方面表现得尤为显著。

紫外线照射可诱导角质形成细胞释放超量自由基。在磷脂酶A2作用下，自由基诱发花生四烯酸的产生，花生四烯酸在环氧化酶与脂质环氧化酶作用下，合成初级炎症因子，如白三烯（LTB4）和前列腺素E2（PGE2）。自由基还通过上调核转录酶NF-kB，促进DNA表达更多的次级炎症因子，如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1。此外，紫外线照射还可以激活细胞内NF-kB、MAPK信号传导通路，诱导IL-6、COX-2等促炎因子表达。

炎症因子（IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1 α等）

图3 不同处理条件下炎症因子含量变化

人永生化角质形成细胞来源于非黑色素瘤的人体正常表皮组织，可以在培养条件下无限期地进行增殖，不会发生自然凋亡。目前，HaCaT细胞已广泛应用于美白保湿、抗衰、划痕实验等多项体外功效检测项目中。

2.基于人皮肤表皮干细胞的抗衰功效测定

表皮干细胞（Epidermal stem cells，EpiSCs）位于表皮基底层，通过整合素附着在下方基底膜上，具有自我更新的能力，并分化为各层皮肤组织。表皮一直处于不断增殖、分化和凋亡的状态。中波紫外线（UVB）的诱变性很强，与DNA相互作用产生胸腺嘧啶二聚体光产物，导致DNA损伤；UVB穿透性强，可渗透到表皮基底层。

图4 表皮干细胞及紫外线对其影响

表皮干细胞是各种表皮细胞的祖先细胞，具有双向分化的能力。它们主要存在于表皮基底层中，是维持皮肤稳态和修复机制的关键。表皮干细胞的干性表达主要体现在其自我更新和多向分化潜能上，这使得它们能够不断产生新的表皮细胞，维持皮肤完整性和功能性。表皮干细胞的干性表达对皮肤抗衰具有重要作用。它们通过促进皮肤修复和再生、维持皮肤弹性和紧致度、调节皮肤炎症反应和免疫系统功能以及促进皮肤细胞代谢等方式来减缓皮肤衰老。因此，保护和促进表皮干细胞的干性表达对于维持皮肤健康和年轻态具有重要意义。

图5 细胞干性表达

3.基于人皮肤成纤维细胞的抗衰功效测定

人皮肤成纤维细胞（Human skin fibroblasts，HSF）主要位于真皮层，在乳头层和网状层中均有分布。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞分化而来。这些细胞具有合成和分泌多种细胞外基质成分的能力，包括胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖蛋白等。HSF的减少是皱纹产生的关键因素。

当皮肤受到损伤时，表皮干细胞会被激活并迁移到伤口处，分化成新的表皮细胞以修复受损组织；通过分泌生长因子和细胞因子等活性物质，刺激皮肤成纤维细胞合成胶原蛋白和弹性蛋白等结构蛋白，使皮肤更加紧致光滑；通过分泌消炎因子等活性物质来减少炎症反应的发生和持续，保护皮肤免受外界损伤和刺激，从而减缓皮肤衰老；促进皮肤细胞代谢，包括细胞分裂、增殖和分化等。

研究人员已明确指出，自然老化过程中皮肤胶原的减少，归因于成纤维细胞合成胶原的能力减弱，同时伴随基质金属蛋白酶（特别是MMP-1和MMP-2）分泌增多。相比之下，光老化导致的皮肤胶原减少，则主要由于成纤维细胞分泌的基质金属蛋白酶显著增加，而胶原合成的降低并不如前者显著。由此可见，在自然老化和光老化这两种皮肤老化过程中，成纤维细胞的胶原代谢机制存在着一定的差异。

图6 MMP1/MMP3表达

图7 Collagen I and Elastin含量

图8 Collagen I and Elastin表达

4.其他衰老相关生物指标的测定

衰老细胞通常体积增大，溶酶体衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。β-半乳糖苷酶在正常人体细胞中主要表达在溶酶体，最适pH为4-4.5；而在衰老细胞中，SA-β-gal大量积累，最适pH偏移至6，因此给予β-gal作用底物X-gal和pH6的环境，衰老细胞可在β-gal的作用下，将底物转变为深蓝色，在普通光学显微镜下可观测。

β-半乳糖苷酶染色图

图9 β-半乳糖苷酶染色图

线粒体功能障碍可能是引发衰老的始动因素之一，除了线粒体膜电位下降外，还包括线粒体质量、形态的异常变化。这些变化会导致细胞能量代谢受损、细胞功能障碍甚至死亡，从而加速细胞衰老。JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质（matrix）中，形成聚合物（J-aggregates），可产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单体（monomer），可产生绿色荧光。

图10线粒体膜电位图

超过80%的面部老化由紫外照射所致，同时皮肤衰老阻碍了自噬的发生。自噬是衰老过程的关键参与者，增加自噬可延缓衰老。采用MDC作为荧光探针来标记和观察细胞自噬体。

图11 细胞自噬通量

丙二醛（MDA）是脂质过氧化反应的产物之一。在细胞衰老过程中，由于活性氧自由基（ROS）的累积和抗氧化机制的失衡，会导致膜脂发生过氧化反应，从而产生丙二醛。这种过氧化反应会损害生物膜及其功能，导致细胞结构和功能的改变，进而加速细胞衰老。TBA法测定MDA含量，MDA在酸性和高温条件下，与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成棕红色三甲川（3,5,5-三甲基恶唑-2,4-二酮），532 nm处比色测定样品中过氧化脂质含量。

图12 细胞内MDA含量

细胞衰老最基本的特征之一，就是发生不可逆转的细胞周期停滞，可能是由有害刺激或异常增殖引起的警报反应。随着细胞衰老进程的推进，细胞周期相关因子p16、p21、p53表达上调，并在衰老细胞中积累，从而导致细胞周期停滞。通过qPCR或免疫荧光手段检测p16、p21、p53表达情况，以评价样品的抗光老化作用。

图13 细胞衰老相关基因表达（p16, p21, p53）

5.抗氧化功效评价

抗氧化是抗氧化自由基的简称，DPPH的氮原子孤对电子/PITO的氧原子孤对电子可与自由基清除剂提供一个电子配对，自身紫红色/蓝紫色变浅，吸光度变化程度与自由基清除程度呈线性关系。因此可通过吸光度变化进行定量分析，从而评价样品的自由基清除能力。

DPPH / PTIO自由基清除实验(生化反应)

图14 DPPH / PTIO自由基清除实验（生化反应）

机体新陈代谢及外界环境刺激（如UV、环境污染、化学试剂等）可能导致自由基的产生，自由基具有较强的氧化能力，当自身疾病或外界刺激过强导致自由基产生增加，而自身抗氧化能力不足以完全消除氧化物，过量自由基导致细胞结构和功能的破坏，以及机体组织损伤和器官病变。因此，采用UVB刺激人永生化角质形成细胞（HaCaT），通过检测样品作用后HaCaT细胞内活性氧（ROS）含量变化，评价样品的抗氧化功效。

图15 ROS含量（DCFH-DA法）

6.抗糖基化功效评价

糖基化终产物（AGEs）是蛋白质、脂肪和糖类结合在一起产生的非酶促反应终产物。

它们会在人体内积累，并逐渐破坏细胞的结构和功能。AGEs的积累会导致细胞膜流动性降低，影响细胞的物质交流和信号传递。随着AGEs的积累，细胞的功能逐渐丧失。这表现为细胞增殖与分化能力下降，代谢速率减慢，以及对外界刺激的敏感性降低等。细胞功能的丧失会导致组织器官功能下降，进而引发各种疾病和衰老现象。

牛血清白蛋白的游离氨基可与还原糖（果糖）的醛基经过缩合、重排、裂解、氧化修饰反应生成带有荧光吸收的AGEs，AGEs含量变化一定程度反应待测样品的抗糖基化活性。CML是由赖氨酸以GO为中间体产生的一种非荧光性、非交联性AGEs，能引发炎症和衰老，导致皮肤损伤，可通过ELISA法对其含量进行测定。

图16 AGEs抑制率和CML含量（ELISA）

上述方法系统性阐述了利用体外细胞培养及模型构建技术来评估抗衰老效果的评价体系。其核心目的在于，针对多样化的功效评估与测试需求，通过体外培养特定类型的细胞或构建细胞损伤模型，并运用目标活性成分进行刺激处理。随后，观察细胞的形态变化、毒性反应及增殖能力等关键指标。在此基础上，进一步运用分子生物学技术，如分析特定基因通路及相关蛋白的表达水平，全面评估原料或成品在抗衰老方面的实际功效。

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